همسانه سازی ژنtpa همراه با توالی های ویژه و انتقال آن به سلول های توتون

کشاورزی مولکولی یکی از دستاوردهای ارزشمند مهندسی ژنتیک در تولید پروتئین های نوترکیب بویژه واکسن ها، آنتی بادی ها ، هورمون ها و ... در گیاهان است. ویژگی های خاص گیاهان به عنوان بیوراکتور آنها را از سایر سیستم های تولیدی متمایز می نماید. پروتئین داروئی tpa tissue plasminogen activator) (به طور اختصاصی و نسبتا قوی به لخته های خونی متصل شده و ترجیحا پلاسمینوژن به دام افتاده در داخل لخته ها را فعال و لخته خونی را از بین می برد. در این تحقیق با استفاده از پپتیدها ی راهنما و الحاقی سعی در افزایش کیفیت و نگهداری پروتیئن نوترکیب شده است. بدین منظور از پپتید های راهنمای kdel extensin, sp-zera, zera, و همچنین پپتیدهای الحاقی ltb cpp, trombin site, his-tag, استفاده شد. این پپتیدهای راهنما و الحاقی بر حسب وظیفه به انتهایc - ترمینال یا n – ترمینال اضافه شد و همچنین یک توالی افزایش دهنده ی بیانی (kozak) به ابتدای ژن اضافه شد. ناقل اصلی برای تمام سازهها pbi121 بود که به عنوان یک ناقل دوگانه در انتقال ژن به گیاهان استفاده می شود. سازه های تهیه شده pkt, pext,) (pspt, pzt ابتدا به اگروباکتریوم سویه lba4404 معرفی گردیدند و به صورت انتقال پایدار و دائمی به توتون منتقل شد. گیاهان تراریخت روی محیط انتخابگر (حاوی کانامایسین mg.l-1 100 ) انتخاب شدند سپس جوانه های تراریخت ریشه دار شده ابتدا به پرلیت و سپس به خاک منتقل شدند. ارزیابی گیاهان تراریخت با استفاده از روش های مختلف مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr)، سادرن بلاتrt-pcr، sds-page، الایزا و زیموگرافی انجام شد. این آزمون ها برای تعیین حضور، تعیین تعداد نسخه، انجام رونویسی، بررسی احتمالی حضور ژن، بیان و مقدار پروتیئن تولیدی و فعالیت پروتئین انجام شد.